Une fois dans la phase stationnaire de croissance, l'action se fait à deux niveaux : le type de bioréacteur et la composition/l'état du milieu de culture. Le premier paramètre permet de calibrer la culture vers une production adéquate de principes actifs. Selon le type de bioréacteur et les conditions de croissance qu'il impose, on distingue :
- Bioréacteurs en boucle fermée : les cellules d'inoculum sont cultivées jusqu'à ce que la phase stationnaire de croissance soit atteinte, le milieu reste toujours le même et le système reste fermé ; de cette façon les cellules commencent par elles-mêmes à produire des métabolites secondaires, puisqu'elles sentent comment un élément suffisant de stress est le manque d'un de leurs nutriments.Les cellules sont conservées dans un système fermé pour produire des métabolites secondaires pendant une période de temps spécifiée, allant de quelques jours à une semaine complète - 15 jours; passé ce délai, le système est ouvert et les métabolites secondaires extraits du milieu et des cellules (certains métabolites restent piégés dans la vacuole tandis que d'autres sont libérés dans l'environnement).
- Bioréacteurs à cycle semi-continu : cycle adapté aux types de cultures qui nécessitent des éléments de stress supplémentaires, en plus du manque de facteurs nutritionnels et de croissance du sol. On l'appelle semi-continu car déjà au milieu de la croissance exponentielle, les cellules commencent à produire des métabolites secondaires ; ceci est probablement dû à une modification du milieu de culture, par exemple due à l'extrusion massive d'un catabolite secondaire de déchet, toxique pour les cellules et donc élément de stress. A ce stade, 50 % de la masse cellulaire est prélevée dans le bioréacteur, avec 50 % de milieu de culture ; les différents principes actifs sont ensuite extraits de cet échantillon.
Une aliquote équivalente de nouveau milieu est ajoutée au bioréacteur dans lequel est contenu le pourcentage restant de cellules et de milieu de culture, de manière à permettre aux cellules de reprendre une phase de croissance exponentielle à partir du temps zéro.Dans ce cas, le système est ouvert lorsque les cellules sont encore en phase exponentielle Le bioréacteur est défini comme « semi-continu » car des quantités faibles mais suffisantes de principes actifs en sont extraites à intervalles réguliers.
Le système de croissance fermé ou semi-continu est choisi en fonction de la capacité productive du type cellulaire, il existe des cellules qui produisent plus de métabolites avec un certain système de croissance plutôt qu'avec un autre.
- Les bioréacteurs à cycle continu : ce sont les plus utilisés, les plus modernes et les plus élaborés. Ils permettent à la culture d'atteindre la phase stationnaire de croissance ; à ce stade, de très petites aliquotes de cellules et de milieu sont prélevées en continu à des intervalles de temps réguliers et rapprochés ; le petit retrait permet au cal de régénérer le même nombre de cellules qui a été retiré, tandis que le milieu collecté est remplacé par un nouveau.De cette façon, les cellules sont maintenues en équilibre sur le fil de la production d'ingrédients actifs; un fil qui représente l'optimisation en termes de qualité et de quantité de la production d'ingrédients actifs. Ce prélèvement constant et continu, ainsi que l'ajout de terreau neuf, est suivi de manière automatisée par des chémostats et turbostats.Le chémostat est l'équipement chargé de surveiller les conditions de culture, telles que le pH et les éléments nutritifs constituant le sol ; lorsque celles-ci ne sont pas suffisantes, l'appareillage intervient en introduisant les moyens correctifs.Les turbostats quant à eux mesurent la densité optique de la culture, qui est directement proportionnelle à la quantité de cellules, lorsque celle-ci atteint une valeur seuil maximale, un une petite quantité est prélevée, puis soumise à l'extraction des ingrédients actifs.
- Les bioréacteurs à cellules immobilisées : une modalité similaire au type boucle fermée, mais elle diffère quand, une fois la capacité de la culture cellulaire à produire des métabolites secondaires vérifiée, des composés gélatinisants ou des supports solides sont introduits dans le bioréacteur qui reste fermé. Ces supports permettent à la culture en suspension de devenir une culture solide toujours à l'intérieur d'un bioréacteur, où les cellules sont sous forme de microagrégats également en contact avec le milieu de culture, donc également sensibles aux stimuli du milieu.Pour certaines cultures cellulaires appartenant à certaines plantes espèce le support solide représente en fait un stimulus mécanique capable d'induire une différenciation morphologique et fonctionnelle sensible ; autrement dit, les cellules commencent, quoique lentement, à se différencier en tissus organisés ; une différenciation morpho/physiologique macro ou microscopique correspond la plupart du temps à une différenciation métabolique En conclusion, l'immobilisation des cultures peut favoriser la production de composés secondaires.
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